嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles）和德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus）是同质发酵乳酸菌，在世界范围内的酸乳生产中起至关重要的作用。这2 种乳酸菌混合培养是微生物联合体的典型案例，在食品发酵行业中与产品品质有着明确联系。这2 种乳酸菌共享相同的生态位，通过交换代谢物和信号分子，具备共生或竞争关系，称为原始合作。通常，S. thermophilus被认为提供甲酸、叶酸、二氧化碳和脂肪酸来启动Lb. bulgaricus的生长，而Lb. bulgaricus被认为产生额外的肽和游离氨基酸满足Streptococcus thermophiles的生物合成需求。此外，这2种菌株还会竞争环境氮的利用，在发酵过程中，它们的代谢物可能会相互影响。因此，原始合作是发酵过程和酸乳产品最终品质的关键决定因素。
特定的微生物菌株和环境条件显著影响酸乳联合体内微生物相互作用的性质和强度。有研究表明，细菌之间的高效共生可以促进相互生长，加快酸化速率，增加胞外多糖的合成，并改善质地和风味形成。然而，这些相互作用的复杂性和多样性仍然未知。最近的研究考察了脲酶、NADH氧化酶等因素对S. thermophilus和Lb. bulgaricus共生关系的影响，然而，这些研究仅限于最广泛使用的发酵剂。此外，酸乳细菌不同接种比例对发酵特性的影响已经引起了工业界的兴趣。因此，为获得理想的特性，如较高的发酵能力、独特的风味、弱后酸化和益生菌效应，筛选更多具有更好协同效应的发酵剂组合，并确定它们的最佳比例，在酸乳生产实践中变得至关重要。后酸化是由发酵剂中的有机酸在低温下的持续积累引起的，会损害产品的稳定性，对生产酸乳造成重大挑战。Lb. bulgaricus的初级乳酸产物D-乳酸已被确定为造成这一问题的主要原因，并与积累后的某些病理有关。因此，有望在酸乳发酵过程中抑制D-乳酸。为应对这一挑战，人们研发多种方法对抗后酸化。其中，选择合适的菌株组合被认为是最安全、有效的解决方法，如选择后酸化能力弱的菌株，同时保证理想的工艺特性，以确保较好的产品品质。
从传统发酵乳制品中分离出来的S. thermophilus CICC 6038和Lb. bulgaricus CICC 6047在实验室条件下结合后，显示出优异的牛乳发酵特性。北京林业大学生物科学与生物技术学院、中国食品发酵工业研究院的Yuanyuan Ge（第一作者）、张柏林教授和姚粟教授级高级工程师（共同通信作者）等对这2种菌株不同的接种比例对发酵时间和后酸化的影响进行研究，并比较菌株活力、酸化活性、挥发性物质、流变特性、有机酸，以及单一培养和共同培养发酵酸乳的后酸化。
结果表明，6 种发酵比例均能成功地将牛乳转化为凝乳。然而，冷藏期间的tpH4.6和∆pH随比例的变化而变化。例如，6 种比率的tpH4.6范围为5.3～7.1 h，S. thermophilus与Lb. bulgaricus的比率越高，到达终点的时间越长（图1A）。冷藏50 d后，S. thermophilus/Lb. bulgaricus比值越高，∆pH值越低。其中，10:1、19:1和50:1比例的发酵乳pH 4.2～4.4（图1B），感官品质令人满意。
利用S. thermophilus CICC 6038和Lb. bulgaricus CICC 6047不同接种比例（1:1、2:1、10:1、19:1、50:1、100:1）在酸乳发酵过程中的pH值，基于改良的Gompertz方程（图1C）和Logistic方程（图1D），生成初级发酵特征模型。图1E所示，用归一化的tpH4.6和∆pH数据计算评价模型中的分值（图1F）。根据评价模型，19:1的比率得分最低，是CICC 6038 / CICC 6047的最优比率。
A. 共同发酵过程中pH值变化；B. 冷藏过程中pH值变化；C. 改良的Gompertz方程；D. 改良的Logistic方程；E. 发酵特性预测；F. 评价模型，包括a：∆pH与接种比曲线；b. 得分与接种比曲线；c. tpH4.6与接种比曲线。
图1 不同接种比例的CICC 6038和CICC 6047的pH值、改良方程、发酵特性预测、评价模型
S. thermophilus和Lb. bulgaricus单一培养的tpH4.6分别为9、7.2 h。相比之下，S. thermophilus＋Lb. bulgaricus共培养所需时间为6.6 h（图2A），表明共培养的发酵速率明显更快。在初始接种剂量为106 CFU/g的条件下，发酵结束时3 组活菌数均达到108 CFU/g（图2B）。发酵结束时，S. thermophilus、Lb. bulgaricus和S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组的可滴定酸度（the titratable acidity，TA）分别为89.5、90.5、93.5 °T（图2C），3 组的平均产酸速率分别为9.94、12.4和14.2 ∆°T/h。
S. thermophilus组在前2 h呈指数级生长，在4 h达到最大生长，在此期间产酸速率比其他2 组快。然而，当pH值降至5.2～5.5时，S. thermophilus的生长受到抑制，pH值下降速率减缓，产酸速率减慢。Lb. bulgaricus组的生长起初受到抑制，但在2～4 h呈指数增长，之后生长速率逐渐下降。pH值和TA在滞后期呈逐渐变化，随后pH值大幅下降，TA增加，特别是在4～6 h。S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组发酵前2 h的酸化活性介于S. thermophilus和Lb. bulgaricus组之间，在2～4 h达到最大值，随后酸化速率略有下降，直至发酵结束。在冷藏期内，S. thermophilus组的后酸化程度最低，其次是S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组，最后是Lb. bulgaricus组（图2D、E）。值得注意的是，在冷藏结束时，共同培养提高了每个菌株的存活活性（图2F）。
A、D. pH值；B、F. 活菌数；C、E. TA。
图2 发酵和冷藏过程中单一培养和共同培养在19:1条件下的pH值、活菌数和可滴定酸度
图3A显示，乳酸是酸乳培养中乳糖分解代谢的主要产物，无论是单一培养发酵还是共同培养发酵，乳酸都随发酵时间的延长而显著增加。单一培养发酵乳的结果表明，S. thermophilus主要合成L-乳酸，D-乳酸是Lb. bulgaricus的主要产物。共同培养发酵产生L（+）和D（−）乳酸异构体，分别主要由S. thermophilus和Lb. bulgaricus产生。在发酵过程中，单一培养S. thermophilus在发酵初期的产乳酸能力强于Lb. bulgaricus，而单一培养Lb. bulgaricus在发酵滞后期后开始快速酸化，在发酵结束时产乳酸量最高。冷藏21 d后，S. thermophilus组和S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组的L-乳酸含量分别降低了134、277 µg/g。相反，D-乳酸在Lb. bulgaricus组增加了760 µg/g，在S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组增加了348 µg/g（图3B）。3 组牛乳中丙酮酸含量均较低，发酵期间丙酮酸含量均有所增加（图3C）。冷藏期间，Lb. bulgaricus单一培养产生的牛乳中丙酮酸含量最低（图3D）。各组的柠檬酸几乎没有变化（图3E、F）。在含有Lb. bulgaricus的发酵液中检测到琥珀酸，且该组琥珀酸含量高于S. thermophilus＋Lb. bulgaricu组（图3G、H）。在冷藏过程中，Lb. bulgaricus组和S. thermophilus＋Lb. bulgaricu组样品中均检测到乙酸，且乙酸含量不断增加，直至冷藏结束（图3I）。
A、B. L-/D-乳酸；C、D. 丙酮酸；E、F. 柠檬酸；G、H. 琥珀酸；I. 乙酸。
图3 有机酸在发酵和冷藏过程中的变化
如图4A所示，S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组和S. thermophilus组的MVI一直保持在较低水平波动，直到3.7 h。之后，随pH值下降到凝胶点，2 组的宏观黏度指数（the macroscopic viscosity index，MVI）开始升高，此时牛乳中的酪蛋白开始形成凝胶结构。而Lb. bulgaricus组MVI升高时间比其他2 组晚1.7 h。在达到凝胶点后，S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组和Lb. bulgaricus组的pH值均继续快速下降，导致样品的MVI急剧上升，分别在6.6、7.2 h左右达到峰值，结束了发酵过程。而S. thermophilus组的pH值在达到凝胶点后缓慢下降，并在9 h后结束发酵过程。发酵过程结束时，S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组的MVI介于S. thermophilus和Lb. bulgaricus组之间。后熟时，S. thermophilus组的MVI降低，S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组和Lb. bulgaricus组的MVI均升高。但S. thermophilus组的MVI仍高于其他2 组。
如图4B所示，弹性指数（elastic index，EI）和MVI具有一致性。在达到凝胶点之前，样品的EI保持稳定，之后EI迅速增加并达到峰值。后熟时，S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组和S. thermophilus组的EI值升高，而Lb. bulgaricus组的EI值降低。
如图4C所示，3 组的固-液平衡（solid-liquid balance，SLB）在达到凝胶点前均有波动，但稳定在0.4～0.45，直至发酵结束。后熟后，S. thermophilus＋Lb. bulgaricus组和S. thermophilus组的SLB保持在0.5以下，说明样品保持稳定的固态。
如图4D所示，各组的流动性指数（fluidity index，FI）在牛乳到达凝胶点之前都有较大的波动，说明样品仍处于液态。之后，3 组的FI迅速下降，并稳定在较低水平，直至后熟时。
A. MVI；B. EI；C. SLB；D. FI。
图4 单一培养和共同培养发酵乳的流变分析
3组共发现77 种化合物，包括17种醛类、16种酮类、13种酸类、12种酯类和19种醇类。这些挥发性物质中，酸类（60.98%～68.57%）和酮类（14.40%～19.13%）含量占比最高，其次是醛类（1.87%～2.89%）、酯类（1.28%～1.49%）和醇类（1.53%～2.63%）。共同培养发酵乳中鉴定出66 种挥发性物质，而S. thermophilus和Lb. bulgaricus单培养发酵乳分别含有60 种和64 种挥发性物质。图5A显示，共同培养发酵比单一培养发酵产生更多的醛类和酯类。图5B显示，3 组共有的挥发性物质有49 种，包括乙醛、2,3-丁二酮等。S. thermophilus组有2 个特有的物质，5-羟甲基糠醛和2-氨基苯乙酮；Lb. bulgaricus组有7 种特有的物质，如2,6-二甲基-5-庚烯醛、己酸丙酯。此外，4 种物质为共同培养发酵乳中特有。
A. 种类；B. 数量。
图5 3 组样品中挥发性风味物质种类及数量
如图6A所示，PC1和PC2贡献率分别为82.5%和12.1%。热图结果显示3 组之间有明显的差异，如图6B所示。
结果表明，乙醛、庚醛、2,3-丁二酮等8 种物质在S. thermophilus发酵乳中相对气味活性值（relative odour activity values，ROAV）均大于等于1。此外，发现6 种ROAV为0.1～1的物质对S. thermophilus发酵乳的香气有显著影响。而Lb. bulgaricus组有6 种ROAV≥1的挥发性物质，如乙醛、壬基醛、2,3-丁二酮等，11 种风味物质（ROAV在0.1～1）显著影响其发酵乳的香气。相比之下，共同培养发酵样品产生了10 种主要的风味挥发性物质，这些物质有助于发酵乳制品的整体味道，如乙醛、庚醛、癸醛等。其中8 种挥发性物质（ROAV为0.1～1）对发酵乳的香气有显著影响。此外，乙醛、2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮和2-丁酮被为3 组发酵乳的关键挥发性物质。
表2 挥发性物质的ROAV
电子鼻PCA结果表明，PC1和PC2贡献率分别为99.3%和0.5%，累计贡献率达到99.8%（图6C）。此外，电子鼻结果表明，样品中存在大量有机物和醇类物质（图6D）。
如图6E所示，共培养发酵的样品比单一培养发酵的样品总体得分更高。尽管S. thermophilus发酵乳的感官特征与共同培养的样品相似，但后者产生了更理想的质地和黏度。
A. PCA分析评分；B. 挥发性物质热图；C. PCA分析电子鼻数据；D. PLS-DA 分析电子鼻数据；E. 感官评价雷达图。
图6 单一培养和共同培养发酵乳挥发性代谢和感官评价
研究表明，特定的S. thermophilus和Lb. bulgaricus对酸乳特性起协同作用，并强调合适比例的重要性。通过建立数学模型对6 个实验比例进行评价，确定S. thermophiles CICC 6038和Lb. bulgaricus CICC 6047比例为19:1，可以获得良好的发酵特性。与单一培养相比，共同培养的酸乳具有更高的酸化活性、更好的流变特性、更丰富的挥发性物质、更理想的感官特性和更高的Lb. bulgaricus冷藏末期存活率，对优化酸乳和其他发酵食品的生产具有重要意义，有助于对微生物共生的理解，从而在不同的生物过程中得到更广泛的应用。
文章链接：https://doi.org/10.3168/jds.2023-23817
专家介绍
张柏林，教授，北京林业大学生物科学与技术学院副院长，教授/博士生导师，兼任林业食品加工与安全北京市重点实验室主任，北京食品学会副理事长，中国经济林协会加工利用分会副理事长，中国微生物学会微生物资源专业委员会理事等职。曾主持和参与科技部863和星火计划等项目，获黑龙江省自然科学技术成果一等奖1项，获北京市科技进步二等奖1项，获北京市教学成果二等奖1项。近年来，发表SCI论文60余篇，参与国家标准制定1项，获授权发明专利2项。长期与宁夏等地企业合作，实现了技术成果转化与企业效益增值。
姚粟，教授级高级工程师，现任发酵工程研发部主任，中国工业微生物菌种保藏管理中心常务副主任。兼任中国微生物学会微生物资源专业委员会委员、中国微生物学会工业微生物专业委员会委员、国际乳品联合会乳品微生物分析方法委员会主席、国际乳品联合会微生物风险评估委员会委员。长期从事食品和药品微生物分类鉴定、菌群结构分析、功能性开发和安全性评价等研究工作。近年来主持国家级、省部级科研项目6项，作为主要研究人员参与国家级、省部级科研项目20余项，发表论文80余篇，其中SCI论文20篇，参加编制国际标准2项，国家标准1项，行业标准2项，国家微生物平台标准3项，授权国家发明专利4项，获得省部级科技进步奖8项，2013年荣获中国食品科学技术学会科技创新奖杰出青年奖。
