《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组
二〇〇四年十二月十日
目 次
前 言………………………………………………………………………………………2
引 言………………………………………………………………………………………3
1 范围…………………………………………………………………………………………4
2 术语、定义、缩略语和符号……………………………………………………………4
3 菌种的纯度检测……………………………………………………………………………4
参考文献………………………………………………………………………………………8
前 言
本规范由科学技术部农村与社会发展司提出。
本规范起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国兽医药品监察所、中国食品发酵工业研究院。
本规范主要起草人：张晓霞、姜瑞波、顾金刚、康孟佼、李世贵、张瑞颖、阮志勇、周宇光、朴春根、叶强、张月琴、陈敏、程池等。
引 言
微生物菌种资源种类繁多，需要针对不同的微生物类群建立简便有效的形态学、生物化学等标准化的纯度检测技术。微生物菌种纯度检测是微生物菌种进行鉴定、保存、评价和利用的前提条件，是确保鉴定结果的准确性和资源保藏质量的基本保障。
制定本规程的目的是为健全质量保证管理体系，保证微生物菌种资源的质量，规范各类微生物菌种资源纯度检测。
微生物菌种纯度检测技术规程
1 范围
本规程规定了古菌、细菌、真菌、病毒（种）纯度检测的程序和方法。
本规程适用于从事微生物菌种资源保藏及研究的机构、大学、企业、个人等。
2 术语、定义
下列术语和定义适用于本规程
2.1 纯度检测 purity check
指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
2.2 纯培养 pure culture
由单个细胞的后代组成的培养物，即单细胞培养物或无性繁殖系。通常是由挑取单个菌落或利用单胞分离技术，移种繁殖获得。
3 菌种的纯度检测
3.1 古菌和细菌的纯度检测
3.1.1 菌落形态
在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
3.1.2 细胞形态
对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜等特征应相似
3.1.3 芽孢大小、位置、形状
宜检测样品是否形成芽孢，对形成芽孢的菌种，其芽孢大小、位置、形状应相似。
3.2 放线菌菌种纯度检测
3.2.1 菌落形态
在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线,挑取单菌落，适宜培养后，在同一平板上单菌落形状、大小、表面状况、质地、光泽、颜色等应相似。如怀疑为细菌污染，则30℃液体培养24小时，培养液不应浑浊，如浑浊则视为细菌污染。
3.2.2 培养特征
分别接种三种以上培养基，在三种以上培养基上的培养特征应想同，包括气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素的颜色等。
3.2.3 孢子丝及孢囊
在特定的培养基、培养温度及培养时间等条件下，孢子着生方式、孢子丝形态及其颜色或孢囊着生位置（气丝或基丝）、孢囊的形状，大小应呈现出一致性。
3.3 酵母菌种纯度检测
3.3.1 菌落形态
应对菌落形态相似性进行检测。在特定的培养基上，通过对待检测菌株进行稀释或划线涂布平板获取单菌落，一定的培养条件下，比较同一平板内，菌落的大小、形状、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽等应一致。
3.3.2 个体形态
应对检测样品的个体形态进行检测。在指定的培养基及培养条件下，细胞形状、大小及细胞的增殖方式应一致。
3.3.3 繁殖方式
酵母繁殖的方式应一致，如是芽殖，出芽的方位、数量应一致。
3.4 丝状真菌菌种纯度检测
3.4.1 菌落特征
菌落的形态等表观特征应一致。
3.4.2 菌丝特征
在特定的培养基和培养条件下，菌丝分隔、菌丝形态等应一致。
3.4.3 其他主要显微特征应一致
3.4.4 检测是否有细菌污染
3.4.5 对于外观上不能确定菌种纯度的，利用单胞分离技术获得纯培养物进行对比，其菌丝、孢子等特征应与原始菌株的描述一致。
3.5 病毒的纯度检测
3.5.1 纯粹检查
应将待检病毒液直接接种含硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪蛋白胨琼脂培养基（G.A）、葡萄糖蛋白胨汤。通过一定温度时间培养后，检查结果应无细菌生长为纯粹。
3.5.2 支原体检查
检测由禽胚组织或其细胞所培养的病毒应用改良Frey氏培养基。检测其它培养方法所得病毒应用支原体培养基。任何一次琼脂平板上出现支原体菌落，判为阳性。阳性对照中至少有一个平板长菌落，而阴性对照中无菌落生长，则检验有效。
3.5.3 外源病毒检查
病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞基质培养，因此，有可能造成外源因子（特别是外源病毒因子）的污染。为了保证制品质量，需要对毒种和细胞进行外源因子检测。
3.5.3.1 病毒种子批外源因子检查
对病毒主种子批或工作种子批，应抽取足够检测试验需要量的供试品进行病毒外源因子检测。在试验前应用特异性抗体（血清）中和本病毒（或单克隆抗体），所用的抗体免疫源应采用与生产疫苗（或制品）不同种而且无外源因子污染的细胞（或动物）制品。如果病毒曾在禽类组织或细胞中繁殖过，则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚，应来自SPF鸡群。以下方法可以选择一种或多种进行。
3.5.3.1.1动物试验法
3.5.3.1.1.1小鼠试验法
取15－20g小鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，每只脑内接种0.03ml，同时腹腔接种0.5ml。至少观察21天。在观察期内至少有80％最初接种的小鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。解剖所用在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接观察期病理改变，并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和颅腔接种另外至少5只15－20g小鼠，并观察21天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。
3.5.3.1.1.2 乳鼠试验法
取出生后24小时内的乳鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，脑内接种0.01ml，同时腹腔接种至少0.1ml。每天观察，至少14天。在观察内至少有80％最初接种的乳鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的乳鼠，直接肉眼观察其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只出生后24小时内乳鼠，并每天观察至接种第14天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。
3.5.3.1.2 细胞培养法
3.5.3.1.2.1非血吸附检查
用经抗血清中和后的病毒悬液，接种于生产用的同种的细胞。细胞至少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25％。于36±1℃培养，观察14天，必要时可更换细胞培养液，未见细胞病变（CPE）为阴性，符合要求。
3.5.3.1.2.2 血吸附病毒检查
上述接种病毒的各个细胞于第6－8天后和第14天，取出2瓶进行血吸附病毒检查。用0.2％－0.5%鸡和豚鼠红细胞混合菌悬液覆盖于细胞表面，分别置于2－8℃，20－25℃，30分钟后显微镜下观察，未见血球吸附现象为阴性，符合要求。
3.5.3.1.3 鸡胚检查法
在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选用9－11日和5－7日龄两组SPF鸡胚，每组至少5只，分别于尿囊腔和卵黄囊接种经抗体血清中和后的病毒悬液，每胚0.5ml。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和鸡血细胞混合悬液做血球凝集试验应为阴性。被接种的鸡胚至少80％存活7天，试验有效。
3.5.3.2 生产用细胞外源因子检查
3.5.3.2.1 细胞直接观察
每批生产用细胞应留取5％（或不少于500ml）,细胞悬液不接种病毒，作为对照细胞加入与疫苗生产相同的细胞维持液，置于与疫苗生产相同的条件下培养，观察14天，在显微镜下观察是否有细胞病变（CPE）出现，无细胞病变（CPE）出现者为阴性，符合要求。在观察期末至少有80％的对照细胞培养物存活，试验有效。
3.5.3.2.2血清吸附病毒检查
对生产用细胞外源因子检查的（1）项细胞培养物在观察期末取至少25％的细胞培养瓶进行血吸附病毒检查。（方法同病毒种子批外源因子检查的血吸附病毒检查）
参考文献
[1] 刘志恒，姜成林主编.放线菌现代生物学与生物技术.北京：科学出版社,Pp1-353. 2004
[2] 杨苏声主编.细菌分类学.北京：中国农业大学出版社,Pp1-145.1997
[3] 沈萍，彭珍荣主译.《微生物学》，第五版，中文版,高等教育出版社，2004
[4] 中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》编写组.常见与常用真菌.北京：科学出版社,P1-317，1978
[5] 中国科学院微生物研究所《菌种保藏手册》编著组.菌种保藏手册.北京：科学出版社,P1-839，1980
[6] David R. Boone et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition. Volume One. Springer. 2001
[7] Kirk P.M., P.F. Cannon, J.C. David and J.A. Stalpers (ed). Dictionary of the Fungi. 9th edition. CABI Publishing. 2001
